HRVATSKI znanstvenici na čelu s prof. dr. sc. Bojanom Polićem otkrili su novi mehanizam kojim „prirodnoubilačke“ stanice obrambenog sustava razvijaju sposobnosti za uništavanje tumora i virusa uz pomoć procesa koji se naziva edukacija.

Njihov rad, napravljen u cijelosti u Zavodu za histologiju i embriologiju Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Rijeci, nastavak je prethodnih istraživanja, a objavljen je u ponedjeljak u Nature Immunology, jednom od dvaju najjačih časopisa za to područje.

Ukratko, riječki je tim otkrio kako prirodnoubilačke stanice obrambenog sustava razvijaju svoju reaktivnost i na koji način postaju hiperaktivne. Pokazali su da su, kada su hiperaktivne, efikasnije u borbi protiv tumora i virusa. Budući da za sada nije zabilježeno da uzrokuju autoimune reakcije, što znači da imaju potencijal da izazivaju manje nuspojava od ostalih stanica obrambenog sustava, one bi mogle biti vrlo korisne za nove imunološke terapije protiv raka.

Što su prirodnoubilačke stanice?

NK stanice ili „prirodnoubilačke“ stanice (engl. Natural killer cells - NK cells) su uz limfocite B i T treća najzastupljenija podvrsta limfocita. Limfociti općenito pripadaju bijelim krvnim stanicama ili leukocitima koji su ključni u obrani organizma od različitih ugroza kao što su infekcije, tumori i sl. One sve prepoznaju bolesne stanice i patogene koji ih napadaju po određenim promjenama u njima. Za razliku od limfocita B i T, NK stanice uče se prepoznati i reagirati na promjene različitih molekula koje oboljele stanice ispoljavaju na svojoj površini poput nekih signala ili poziva u pomoć. Sposobne su razlučivati različite faktore i ubiti oboljele stanice kako bi ograničile nastalu ugrozu. Kruže i patroliraju tijelom i odmah reagiraju na svaku promjenu koja odudara od normalnog stanja stanica (tzv. stanje „staničnog stresa“). Nastaju u koštanoj srži iz hematopoetske matične stanice, kao i druge bijele krvne stanice. Stalno se proizvode, a njihov razvojni put do zrelosti traje oko tjedan dana.

NK stanice imaju veliki potencijal

Polić je za Index objasnio ključnu razliku između NK stanica i T i B stanica zbog koje su NK u posljednje vrijeme sve interesantnije za znanstvenike koji istražuju mogućnost njihova korištenja u antitumorskim terapijama.

„Receptori NK stanica tijekom razvoja uspostavljaju prag za njihovu aktivaciju. T i B stanice nose samo po jedan receptor koji prepoznaje specifično jednu vrstu problema. NK stanice ih imaju cijeli niz, kako aktivacijskih, tako i inhibicijskih, a ravnoteža među njima određuje prag njihove aktivacije, odnosno njihovu osjetljivost“, rekao je Polić.

„Do sada se uglavnom mislilo da je za određivanje praga aktivacije potrebno da NK stanice nauče prepoznavati antigene stanica vlastitog organizma, odnosno da se moraju potaknuti inhibicijski receptori koji nekim nepoznatim mehanizmom određuju prag aktivacije čime se sprječava mogućnost da se NK stanice okrenu same protiv vlastitih stanica, odnosno da se razvije autoimuna reakcija. Kod T i B stanica one koje bi mogle djelovati autoimuno već su tijekom razvoja odbačene ili kasnije postaju utišane. Kod NK stanica prag aktivacije se podešava jer su one orijentirane prema značajno većem broju antigena, a ne prema jednom. One su u biti usmjerene prema promjenama stanja stanica i prepoznaju sve koje su pod stresom, odnosno koje su tumorske, inficirane ili su metabolički promijenjene. Takve bolesne stanice na svojoj površini počnu ispoljavati određene molekule za koje su NK stanice razvile receptore pa se aktiviraju i kontroliraju ih – uništavaju ih ili pak luče citokine koji suzbijaju razmnožavanje virusa“, pojasnio je.

Receptor - ključ učinkovitosti

Riječki tim u svojem je istraživanju otkrio jedan aktivacijski receptor koji je ključan za NK stanice jer njegovo isključivanje potiče na hiperaktivnost druge aktivacijske receptore.

„Došli smo do otkrića da ta hiperreaktivnost ide preko dva vrlo važna receptora NCR1 i CD16. U nedostatku trećeg receptora koji se zove NKG2D oni postaju hiperaktivni. Na taj način NK stanice, utišavanjem ili u nedostatku receptora NKG2D, postaju značajno aktivnije u uništavanju tumora ili pak bolje u kontroli virusne infekcije. Mi smo htjeli saznati kada se to događa, u kojoj fazi razvoja stanica“, kaže Polić.

Sveti gral borbe protiv tumora

Danas se u svijetu razvijaju brojne terapije u kojima se limfociti obrambenog sustava koriste u borbi protiv tumora. Nazivaju se imunoterapijama, a pokazale su se uspješnijima od svih ostalih oblika borbe protiv tumora jer su tumori vrlo raznovrsni. Može se reći da praktički ne postoje dva ista tumora; čak ni stanice jednog tumora nisu sve istovrsne. U tom smislu mogu se usporediti sa stablom na kojem grane i grančice nisu međusobno istovjetne, već se svaka razvija na neki svoj način.

Jedna takva imunoterapija, poznata kao CAR terapija, svojevremeno je privukla veliku pozornost hrvatskih medija kada joj je trebala biti podvrgnuta mala Nora Šitum. Nažalost, ona je bila previše bolesna da bi je dočekala.

Za sada skupe, no cijene padaju

U CAR terapijama na limfocite se ugrađuju različiti receptori koji se potom usmjeravaju protiv tumorskih stanica. Njima su u SAD-u i u svijetu postignuti veliki uspjesi u borbi protiv tumora. Brojni ljudi koji su imali tumore, čak i u terminalnoj fazi, potpuno su izliječeni njima. Problem je u tome što su one za sada još uvijek vrlo skupe - nerijetko koštaju više stotina tisuća pa i do milijun dolara jer su individualizirane, a za njihovo dizajniranje potreban je skupni rad velike ekipe vrhunskih stručnjaka. No zato su prilično efikasne, a za očekivati je da će s razvojem tehnologije njihova cijena padati. To se već događa pa su se neke našle i na popisu HZZO-a.

Potencijal NK stanica

Za sada se u terapijama uglavnom koriste T stanice, međutim, Polić ističe da bi se na sličan način mogle koristiti i NK stanice.

„NK stanice su osobito zanimljive upravo zato što su kod T limfocita u nekim slučajevima zabilježene jake autoimune reakcije, pa čak i smrti. NK stanice imaju prednost da imaju inhibicijske receptore koji kontroliraju njihovu hiperaktivnost prema zdravim stanicama i tkivima, a istovremeno imaju potencijal da se koriste u terapijama protiv tumora. Za sada još nisu u kliničkoj upotrebi, no mnogi laboratoriji rade na tome.

Zanimljivo je da nismo vidjeli da NK stanice izazivaju autoimune reakcije. Do sada nije uočen niti jedan fenomen u kojem bi NK stanice uzrokovale autoimune reakcije koje mogu biti vrlo opasne za bolesnike“, kaže Polić.

Kako NK stanice uče?

Rezultati dosadašnjih istraživanja pokazali su da proces „učenja“ NK stanica ovisi o inhibicijskim receptorima koji moraju biti potaknuti tijekom njihova razvoja kako bi njihovi aktivacijski receptori bili podešeni na određenu reaktivnost. Drugim riječima, ako inhibicijski receptori nisu potaknuti tijekom razvoja, NK stanice postaju nereaktivne ili slabo reaktivne preko svojih aktivacijskih receptora. Posljedica je slabija kontrola nastanka tumora i infekcija. 

„Poznavanje mehanizma 'učenja' NK stanica stoga je vrlo važno kako bismo eventualno mogli manipulirati njihovu reaktivnost u smislu terapije tumora ili infekcija“, tumači Polić.

Detalji otkrića u novom radu

Prije desetak godina tim iz riječkog laboratorija uspio je genetskom manipulacijom napraviti miševe kojima nedostaje gen za NKG2D, aktivacijski receptor na NK stanicama koji je izražen na najranijim razvojnim oblicima ovih stanica.

Suprotno očekivanjima, tim je uočio da su ove stanice u mutiranih miševa hiperreaktivne i da bolje kontroliraju virusnu infekciju. Nastavili su istraživati ovaj fenomen da bi nedavno uočili da je ta povećana reaktivnost NK stanica specifična, odnosno da ide preko dvaju drugih važnih aktivacijskih receptora, NCR1 (NKp46) i CD16, koji su, baš kao i NKG2D, izraženi na gotovo svim zrelim NK stanicama. Pokazalo se da NK stanice bez NKG2D znatno bolje kontroliraju tumore koji izražavaju molekule za NCR1 receptor. Kako bi utvrdili je li ovaj fenomen posljedica „učenja“ NK stanica tijekom razvoja, napravili su miševe u kojima su mogli mutirati gen za NKG2D pri kraju razvojnog puta NK stanica. Uočili su da u tom slučaju više nema hiperreaktivnosti NK stanica. To je značilo da NKG2D specifično regulira reaktivnost NK stanica preko receptora NCR1 i CD16  tijekom njihovog razvoja, odnosno da jedan aktivacijski receptor - NKG2D - sudjeluje u „učenju“ aktivnosti dvaju drugih aktivacijskih receptora - NCR1 i CD16. U radu su također pokazali koje signalne molekule sudjeluju u ovom procesu. Ovaj nalaz odudara od do sada poznate teorije o edukaciji NK stanica i baca novo svjetlo na taj proces.

Dragocjeni miševi s imenima znanstvenika

Polić kaže da je njihov laboratorij prvi uveo ciljanu mutaciju gena i proizvodnju genetski modificiranih miševa specifičnom tehnologijom u Hrvatskoj. Miševi s mutiranim genom za NKG2D bili su među prvima koje su napravili.

„Mutaciju gena napravili smo u mišjim embrionalnim matičnim stanicama iz kojih se razvija čitav embrio. One su bile podrijetlom iz crnih miševa. Iste smo mikroinjicirali u rane embrije normalnih, bijelih miševa koji imaju svoje embrionalne matične stanice kako bismo dobili kimerične miševe, odnosno miševe koji su izgrađeni iz jednih i drugih matičnih stanica. Dobivene kimere bile su šarene, crno-bijele, a krajnji cilj bio je da se njihovim parenjem s normalnim miševima prenese mutacija NKG2D gena na njihovo potomstvo. S obzirom na složenost i dugotrajnost cijelog postupka dobivanja kimera, svaki kimerični miš bio je vrlo dragocjen pa smo im dali imena po znanstvenicima i tehničarima na našem Zavodu. Gotovo svaki član Zavoda imao je „svog“ kimeričnog miša. Kako su različite kimere imale i različit rezultat u smislu prenošenja mutacije na potomstvo - neke su bile produktivnije i uspješnije od drugih - to je bila podloga za zbijanje brojnih šala koje su nam pomogle da skratimo vrijeme i održimo entuzijazam za vrijeme cijelog postupka“, ispričao je Polić.

Na pitanje je li neki od miševa dobio ime Mišo, odgovorio je da nije, jer, nažalost, u timu nemaju nikoga s tim imenom; imaju samo jednog Miru i istoimenog miša (na slici gore).

Zašto je važno ovo otkriće?

Kako su NK stanice vrlo moćne u svom antitumorskom i antivirusnom djelovanju, postoji veliki potencijal njihove uporabe u terapeutske svrhe. Poznavanje molekularnih mehanizama koji su važni u uspostavljanju njihove reaktivnosti daje mogućnost da se njima manipulira kako bi se pojačala njihova reaktivnost u borbi protiv tumora ili virusnih infekcija.

Poznato je da prilikom alogene transplantacije koštane srži (od nesrodnih davatelja) kod liječenja leukemija dolazi i do reakcije presađenih NK stanica prema leukemijskim stanicama što je povoljno za izlječenje pacijenta. Kako bi se pojačao taj učinak, posebno se biraju donori koji imaju specifične nepodudarnosti s primateljem presatka koje potiču reaktivnost NK stanica, ali ne i limfocita T (i B) koji bi mogli prouzročiti oštećenja zdravih tkiva. 

Nekoliko podataka o izradi rada

Tijekom istraživanja napravljeno je nekoliko stotina različitih eksperimenata, upotrijebljeno je 15-ak genetički modificiranih sojeva miševa, a korištene su brojne suvremene metode u imunologiji te u molekularnoj i staničnoj biologiji.

"Najveći doprinos radu dala je Vedrana Jelenčić, koja je i prvi autor istoga, te Felix Wensveen, a svoj doprinos dali su i Marko Šestan, Inga Kavazović, Maja Lenartić, Sonja Marinović i Berislav Lisnić. U nekoliko eksperimenata koji su zahtijevali specifične analize koje nismo mogli napraviti na našoj matičnoj ustanovi surađivali smo s prof. Yenanom Brycesonom i dr. Timom Holmesom s Instituta Karolinska, u Stockholmu, u Švedskoj te s prof. Veronikom Sexl i dr. Michaelom Prchal-Murphy s Veterinarskog sveučilišta u Beču, u Austriji", rekao je Polić.